RNA提取純化的注意事項

由于RNA酶的廣泛存在與難以滅活的頑固特性。使得RNA的提取純化和后續(xù)工作變得非常困難。

1. RNases 是非常穩(wěn)定和活躍的一種酶，一般不需要輔助因子的功能，因而在實驗室內(nèi) RNA 很容易被降解
2. 如果不預先消除可能的 RNase 污染，請不要使用任何塑料制品或玻璃制品
3. 純化的 RNA 溶解在 RNases-free 的水中，在 –20℃或 –70℃進行儲存長達一年不會引起 RNA降解

    對于使用 RNeasy Kit 進行 RNA 純化，一般不要求額外的 DNase 消化過程，這是因為 QIAGEN的 RNeasy 硅膠膜技術(shù)能夠高效去除大部分的 DNA。然而，對于某些基于 RNA 的敏感應用，我們建議同時使用 RNase-free DNase Set（操作流程可以參見 RNeasy 產(chǎn)品說明書）對 DNA 進行消化，確保得到的 RNA 無任何 DNA 的污染。

     RNA工作的主要問題是防止RNA酶的污染。除了操作時需要注意RNA酶，那么針對不同類型的樣本，進行RNA純化時有哪些需要注意的地方呢？

從富含纖維的組織中分離 RNA（如心臟或肌肉組織等）有一定難度，這是因為纖維組織中的收縮蛋白，結(jié)締組織，膠原等成分都會干擾 RNA 的純化過程。所以為了去除這些蛋白的影響，組織樣本需要用含有蛋白酶或含酚的裂解液。同時上述處理條件不能引起 RNA 降解，QIAGEN 推薦使用 RNase-free proteinase K 進行消化。

固定和包埋的過程能導致核酸的嚴重降解和化學修飾，通常我們從 FFPE 樣本中純化得到的核酸的分子量要小于新鮮或冰凍組織。核酸降解/片段化的程度依賴于樣本類型和年齡，另外和固定，包埋和儲存條件也有很大關(guān)系。

請依照以下建議進行 FFPE 樣本的處理，以減少對 RNA 的損傷

• 盡快取出組織樣本并進行固定
• 組織樣本的厚度不要超過 5 mm，固定時間不要超過 24 小時
• 使用高質(zhì)量試劑進行石蠟包埋，不要使用添加劑
• 如果可能的話，避免對樣本進行染色
• 儲存 FFPE 樣本的條件要合適，如在 4 度進行存放長達 1 年，仍可純化到高品質(zhì) RNA
• 使用合適的脫蠟溶液進行脫蠟處理
• 在 RNA 純化過程要有逆轉(zhuǎn)交聯(lián)的步驟，便于大程度釋放 RNA 分子
• 去除基因組 DNA 的污染

全血中紅細胞沒有細胞核，每毫升血液中實用細胞數(shù)少，核酸得率比較低，所以從全血中分離的目標是白細胞。此外，還必須除去污染物如抗凝劑肝素和 EDTA 以及天然存在的酶抑制劑，這些物質(zhì)都會干擾下游的 RNA 分析。QIAamp RNA Blood Kits 高度適合從人血液樣本中純化高品質(zhì)RNA，能消除 RNases，污染物和酶抑制劑，同時大程度去除基因組 DNA 的污染。

RNA 尤其是 miRNA 可在血清，血漿，尿液和其他體液中存在，并且也存在于細胞培養(yǎng)液的上清液中。胞外 RNA 的含量比胞內(nèi) RNA 要低的多，但是它相對穩(wěn)定，在人全血中的半衰期約為 2天。然而，多次反復凍融仍然會導致純化效果變差。推薦純化過程中使用 carrier RNA 來提高游離 RNA 的回收效率。

一些病毒具有單鏈或雙鏈 RNA 基因組。病毒 RNA 通常是分離自無細胞體液中，而這些樣本中病毒核酸的含量非常低。 病毒顆粒可能需要通過超速離心，超濾或沉淀的方式進行濃縮。推薦純化過程中使用 carrier RNA 來提高游病毒 RNA 的回收效率。另外推薦使用合適的逆轉(zhuǎn)錄酶對某些含有復雜二級結(jié)構(gòu)的病毒核酸進行逆轉(zhuǎn)錄。