基因組DNA提取純化的注意事項(xiàng)

大多數(shù)動(dòng)物組織可以用裂解緩沖液和蛋白酶/蛋白酶 K 進(jìn)行高效裂解。在加入裂解液之前需要將組織切成小塊，有條件的話建議使用 TissueLyser 或研缽等提前進(jìn)行均質(zhì)化。骨骼肌，心臟，皮膚等組織含有收縮蛋白，結(jié)締組織和膠原蛋白，所以利用蛋白酶 / 蛋白酶 K 進(jìn)行充分消化是必須的。

FFPE 樣本進(jìn)行 DNA 純化時(shí)需要預(yù)裂解。福爾馬林可由 PBS 洗滌除去，石蠟可由二甲苯和乙醇進(jìn)行去除。在蛋白酶消化后提高孵育的溫度有助于逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，以便更好的從 FFPE 組織中釋放 DNA，從而有助于提高 DNA 產(chǎn)量和改善下游檢測(cè)性能。 從 FFPE 中得到的 DNA 通常比從新鮮或凍存樣本中得到的 DNA 分子量?。籇NA 降解的程度則取決于樣本類型，儲(chǔ)存時(shí)間和固定的條件。

微量樣本中 DNA 的含量很低，通常小于 5 ng DNA, 通常需要使用 carrier RNA 來(lái)提高產(chǎn)量（不會(huì)影響下游分析檢測(cè)）。如果需要使用 carrier RNA，那么在測(cè)量 OD 的時(shí)候會(huì)因?yàn)槭褂?carrier RNA 造成濃度測(cè)量有偏差（因?yàn)?RNA 在 260 nm 也有吸收）。

推薦使用 QIAamp DNA Micro Kit 從微量樣本中進(jìn)行 DNA 純化，該試劑盒采用 MinElute 硅膠膜柱，洗脫體積可以低至 20 μl，同時(shí)通過(guò)兩步洗滌去除 PCR 抑制劑等污染物，大程度從微量樣本中純化 DNA。

血液樣本可以是新鮮或凍存全血或干血片，由于血液樣本在采集后會(huì)迅速凝固，所以通常在采血時(shí)使用 EDTA，檸檬酸鹽或肝素進(jìn)行抗凝。經(jīng)過(guò)抗凝處理的血液樣本可以直接用于 DNA 純化，需要注意的是使用的 DNA 純化方法需要能夠去除上述抗凝劑，以免干擾下游 PCR 檢測(cè)。全血也可以在 DNA 純化前先進(jìn)行白細(xì)胞富集等再進(jìn)行 DNA 純化。

從血液中純化 DNA 的產(chǎn)量很大程度上取決于血液中的白細(xì)胞數(shù)量，而白細(xì)胞數(shù)量則和血液的供體情況有很大關(guān)聯(lián)（如貧血或感染都會(huì)造成白細(xì)胞數(shù)量變化）。上述情況必須在進(jìn)行 DNA 純化前就應(yīng)該考慮到。此外，有些動(dòng)物有有核血，這意味著這類樣本中含有更多的 DNA，在從此類血樣中純化 DNA，上樣量需要減少 10 倍左右。

1. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以使用蛋白酶 K 進(jìn)行裂解
2. 酵母細(xì)胞需要首先使用溶菌酶對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行處理，然后使用蛋白酶或蛋白酶 K 進(jìn)行消化
3. 許多**細(xì)胞可以使用裂解 buffer 和蛋白酶 / 蛋白酶 K 進(jìn)行裂解，某些**如革蘭氏陽(yáng)性菌需要預(yù)先使用溶菌酶對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行處理
4. **細(xì)胞需要先從生物體液中沉淀，然后從中純化** DNA，拭子樣本需要先使用**劑進(jìn)行預(yù)處理然后再離心
5. 使用機(jī)械裂解會(huì)比用酶消化的效果要好，尤其是針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌或**而言